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我國作為農業(yè)大國秸稈資源量豐富,但利用率較低造成了資源浪費和環(huán)境污染,利用秸稈生產(chǎn)沼

氣是提高秸稈利用率和緩解環(huán)境污染的有效途徑之  。新型沼氣池沼氣發(fā)酵是在多種微生物共同作用下完成的,

溫度,濃度,接種物,CN3,pH值和攪  拌“以及物料成分配比等對厭氧發(fā)酵有重要影  響。氮素是影響新型沼氣池沼氣發(fā)酵重要的營(yíng)養元素之一,秸稈的碳氮比極高,這意味著(zhù)以秸稈為原料的新型沼氣池沼氣發(fā)  酵體系中氮素對于發(fā)酵過(guò)程的影響可能更大,優(yōu)化發(fā)酵條件有利于微生物迅速繁殖,從而提高反應器性能和新型沼氣池沼氣產(chǎn)量。

根據秸稈的分子式計算秸稈完全液化能夠提供厭氧發(fā)酵微生物所需的氮),但秸稈在實(shí)際發(fā)酵過(guò)程中很難全部被利用,且分解時(shí)間較長(cháng),微生物所需的氮含量不能在發(fā)酵各個(gè)階段滿(mǎn)足微生物的需求,尤其是在發(fā)酵初始階段,影響了新型沼氣池沼氣工程的發(fā)酵效率和最終產(chǎn)量。余少杰等通過(guò)添加不同濃度的氯化銨來(lái)研究外加氮源對秸稈厭氧發(fā)酵的影響,研究結果0顯示適量濃度的氮添加可以促進(jìn)厭氧發(fā)酵體系中纖維素等物料的水解,而高濃度的氮素添加會(huì )抑制纖維素水解和甲烷生成。 Pia tek等通過(guò)模型分析發(fā)現氮含量是影響水解和甲烷生成過(guò)程動(dòng)力學(xué)的關(guān)鍵因素。 Wagner等研究了添加不同種類(lèi)的氮源在厭氧發(fā)酵過(guò)程中對甲烷產(chǎn)量的影響,發(fā)現  氮源中碳含量會(huì )影響甲烷的產(chǎn)率,在適宜的濃度范  圍內才能獲得較高的甲烷產(chǎn)量。雖然原料中碳素轉  化為CH4和CO2是碳素間的循環(huán),但在厭氧發(fā)酵  中,微生物是將秸稈中的碳素轉化為CH4的功能執  行者。 Wagner等從多樣性指數上分析了不同氮  源對微生物多樣性的影響,但未對功能菌株的豐度

變化進(jìn)行闡述。 Alsouleman'14-15等研究發(fā)現,高氨  氮脅迫下厭氧反應體系發(fā)生適應性變化,主導菌群  從擬桿菌轉變?yōu)樗缶?。隨著(zhù)宏基因組測序技術(shù)的快  速發(fā)展,應用宏基因組技術(shù)來(lái)研究樣本中直接參與  碳和氮循環(huán)的功能微生物類(lèi)群的總量和多樣性是近年來(lái)環(huán)境微生物的研究熱點(diǎn)之一,但對添加氮素后微生物群落多樣性以及功能基因的變化以及如何影響發(fā)酵體系和甲烷產(chǎn)量的研究鮮有報道。因此,研究氮素添加對新型沼氣池沼氣發(fā)酵過(guò)程中微生物群落和關(guān)鍵功能基因的影響具有重要意義。

本研究解析玉米秸稈新型沼氣池沼氣發(fā)酵過(guò)程中添加氮素對料液中微生物多樣性的影響,探究產(chǎn)甲烷關(guān)鍵功能基因豐度的變化,通過(guò)計算纖維素等物料的降解情況并結合產(chǎn)氣量與產(chǎn)氣周期,從微生物和功能基因的角度揭示氮素添加與秸稈新型沼氣池沼氣產(chǎn)量之間的關(guān)系,解析發(fā)酵過(guò)程中不同階段細菌、古菌的多樣性與  功能特征,注釋功能菌株的豐度的變化,進(jìn)一步探究

新型沼氣池沼氣發(fā)酵中關(guān)鍵因子的作用,為提高玉米秸稈新型沼氣池沼氣發(fā)酵產(chǎn)氣效率提供數據支撐。

1材料與方法

1、1試驗原料

試驗用玉米秸稈取自黑龍江八一農墾大學(xué)實(shí)驗實(shí)習基地,在10月份收獲籽粒后,秸稈風(fēng)干粉碎備用,接種污泥源于本實(shí)驗室運行良好的厭氧發(fā)酵反應器,主要性質(zhì)見(jiàn)表1,其中玉米風(fēng)干秸稈的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量分別為30.52%,27.77%和10.99%。

1.2間歇式秸稈新型沼氣池沼氣發(fā)酵體系建立

試驗裝置選用25L自制厭氧發(fā)酵反應器,上設有出氣口和進(jìn)料口,下設有出料口。出氣口與15L集氣袋相連,用于收集氣體并測定體積(見(jiàn)圖1)。甲烷含量通過(guò)GA2000便攜式新型沼氣池沼氣分析儀( GeotechBiogas Check)測定。發(fā)酵體積為20L,接種污泥12L,總TS設定為8%,啟動(dòng)時(shí)秸稈一次性進(jìn)料,不足蒸餾水補齊。

根據前期單因素試驗結果,選取添加有機氮尿素1gL作為處理,不加氮為對照,設置3個(gè)重復,控制發(fā)酵溫度為35℃,反應時(shí)間60d。隨著(zhù)發(fā)酵的  進(jìn)行,每10d進(jìn)行1次投料,物料添加量為總秸稈添加的1/6

1.3試驗方法

1.3.116 SrrNA測序

在前期連續進(jìn)料的新型沼氣池沼氣發(fā)酵試驗中,對照和處

理分別在發(fā)酵的第1.10,40天和60天進(jìn)行取樣,每

個(gè)樣品平行取3次,混合均勻后加入緩沖液( Extrac

tion Buffer)-20℃保藏。利用改進(jìn)的氯化芐法提取  樣品總DNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,使

用 Nanodrop200e(Them)檢測DNA的純度和濃

度。將合格的樣品總DNA送至四川博貝特生物科

技有限公司進(jìn)行高通量測序。PCR擴增引物對應

區域:細菌16V4區引物515F(5′ GTGCCAGO

MGCCGCGGTAA3)和909R(5′ CCCCGYCAATTC  MTTTRAGT3)。古菌引物344F(5′ ACGGGGYG

CAGCAGGCGCGA3)和806R(5′ GGACTACH

VGGGTWTCTAAT-3)

1.3.2統計分析

研究采用 oniginpro2017軟件對試驗數據進(jìn)行處理和分析。

1.3.3宏基因組學(xué)分析

在第一次產(chǎn)氣高峰第10天進(jìn)行取樣,處理與對照樣品平行取3次,混合均勻后加入緩沖液( Extraction Buffer),將樣品送至上海派森諾公司進(jìn)行DNA提取和宏基因組測序。

1.3.3.1物種注釋

將每個(gè)樣本的 Scaffolds/ Scanties序列與NCBlNT數據庫中的細菌、古菌、真菌和病毒序列進(jìn)行  BLASTN相似性比對(E值設定為<0.001)。由于每一條目標序列可能匹配多條參考序列,而這些匹配的參考序列又分屬不同的分類(lèi)單元,為使分析嚴謹可靠,同時(shí)又不丟失生物學(xué)意義,我們在 MEGAN軟件中采取“最低共同祖先( Lowest Common Ancesor,LCA)”算法),將參考序列分化為不同物種分枝前的最后一級共同分類(lèi),作為目標序列的物種分類(lèi)注釋信息。結合 Scaffolds/ Scaftigs序列在各樣本中的豐度數據,獲得各樣本在所需分類(lèi)等級上的相對豐度分布表

1.3.3.2功能注釋

基因的功能注釋是將非冗余蛋白序列集同常用的蛋白數據庫進(jìn)行比對,從而對各樣本中的基因功能進(jìn)行注釋分析。KEGG注釋是指通過(guò)將蛋白序列和KEGG代謝通路數據庫進(jìn)行比對,對宏基因組預測得到的基因根據代謝通路進(jìn)行注釋和分類(lèi)。我們將上述非冗余蛋白序列集上傳至KAS( KEGG AutomaticAnnotation Server)進(jìn)行功能注釋,并對返回的  g  注釋結果進(jìn)行匯總統計,獲取各等級的注釋結果及

對應的豐度信息。

2結果與分析

2.1添加氮素對間歇式秸桿新型沼氣池沼氣發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響

在發(fā)酵的前28d,處理的日產(chǎn)氣量穩定且高于對照(見(jiàn)圖2),在第10天達到第1個(gè)產(chǎn)氣高峰,為17750mLd-。處理和對照均在第25天達到產(chǎn)氣高峰,分別為15077mLd-和11707mL·d-。從第28天到第41天,對照恢復其產(chǎn)氣潛力,日產(chǎn)氣量高于處理,發(fā)揮產(chǎn)氣優(yōu)勢。發(fā)酵前30d進(jìn)料對產(chǎn)氣量的變化并不明顯,從第40天開(kāi)始,處理和對照在產(chǎn)氣量上無(wú)顯著(zhù)性差異,產(chǎn)氣趨勢相似。產(chǎn)氣量在每次進(jìn)料后均上升,之后開(kāi)始下降,到下一次進(jìn)料產(chǎn)氣量又出現了顯著(zhù)提升。測定發(fā)酵結束后纖維素和半纖維素降解率,處理達到33%和44%,顯著(zhù)高于對照的6%和28%。

日產(chǎn)甲烷量變化趨勢與日產(chǎn)氣量的變化趨勢相似,筆者對發(fā)酵進(jìn)行不同天數后的累積甲烷產(chǎn)量進(jìn)行統計分析(見(jiàn)圖3),發(fā)酵前10d,20d,30d處理的甲烷累積產(chǎn)量分別是64943mL,137048mL,199459mL,顯著(zhù)高于對照的14110mL,50343mL,123720mL。發(fā)酵前40d,處理的甲烷累積產(chǎn)量仍高于對照。發(fā)酵結束后,處理的甲烷總產(chǎn)量為308200mL,仍然高于對照的284728mL。處理在第10天達到第1個(gè)產(chǎn)甲烷高峰,為10880mL·d-1。對照在第20天達到一個(gè)峰值,為6103mL·d-1。處理和對照均在第23天達到日產(chǎn)甲烷產(chǎn)量的最高峰,分別為1388mL·d-和8164mL·d。從第26天到第41天,對照日產(chǎn)甲烷量高于處理。從第41天到發(fā)酵結束,處理和對照的甲烷產(chǎn)量無(wú)顯著(zhù)差異。

發(fā)酵料液中提取的7個(gè)樣品總DNA條帶清晰,雜質(zhì)較少,無(wú)嚴重拖尾現象。 Nanodrop檢測出的DNA濃度在197.8~380.9ng·L之間,OD260/280在1.90~2.07之間,均符合送樣要求(濃度>10ng·L-;OD260/280在1.8-2.2之間)。對7個(gè)樣品中的細菌和古菌的16 SrRNA V4區序列進(jìn)行高通量測序。對比 Shannon指數可以看出(見(jiàn)表2),古菌的 Shannon指數均低于細菌,說(shuō)明細菌的微生物多樣性要高于古菌的多樣性。比較處理和對照中的細菌 Alpha多樣性指數,發(fā)酵第10天處理高于對照,隨著(zhù)發(fā)酵的進(jìn)行,對照 Shannon指數增加,說(shuō)明其多樣性有所增加,而處理的 Shannon指數和simpson指數均呈下降趨勢,微生物多樣性下降。從古菌的 Alpha多樣性指數變化規律可以看出,處理中古菌多樣性的變化規律同處理中細菌變化一致。

2.2.2發(fā)酵料液中細菌和古菌群落組成分析  將細菌的各菌群豐度占比1%以上的25類(lèi)菌  屬作圖(見(jiàn)圖4),從屬的分類(lèi)水平進(jìn)行分析,發(fā)酵原  料中 Clostridium占比最高。對照中,普氏菌屬(Pre  wdla)、擬桿菌屬( Bacteroides)、瘤胃球菌屬(Rumi  m)和 Sphaerochaeta占比較高。處理中Ramnofilibacter,螺旋體屬( Treponema)和 Sphaerocho占比較高。比較發(fā)酵各時(shí)期對照和處理均表現出不同的細菌菌群組成,二者優(yōu)勢菌群各不相同,菌群多樣性存在差異。比較對照和處理發(fā)現, Sphaerochaea菌屬在發(fā)酵的各時(shí)期均存在。

古菌的各菌群豐度在屬的分類(lèi)水平上分析(見(jiàn)圖5),在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中,甲烷鬃毛菌屬( Methano-ea)(36.7%~68.7%)一直占據最高比例。對照中占比較高的菌群包括 Methanosaeta(45.8%5.1%), Methanoculleus(5.6%~16.2%)。處理中占比較高的菌群包括 Methanosaeta(36.7%~68.7%),

Methanoculleus(7.2%-14.2%)和甲烷螺旋菌屬Methanospirillum)(6.6%-85%)

在發(fā)酵第10天時(shí),對照中 Methanosaeta的豐度為57.1%,處理為36.7%,優(yōu)勢菌群 Methanosaeta的數量隨氮濃度的增加而減少。隨著(zhù)發(fā)酵的進(jìn)行,處理中的 Methanosaeta豐度逐漸增加,但對照中卻

在中期開(kāi)始減少。說(shuō)明 Methanosaeta在氮素充足的環(huán)境中缺少競爭力,豐度下降。只有在環(huán)境中營(yíng)養成分缺少的情況下 Methanosaeta的競爭力才開(kāi)始顯現,成為環(huán)境中的優(yōu)勢菌屬。 Methanoculleus的豐度也受氮素的影響,其豐度隨著(zhù)氮濃度的升高而增加,Methanoculleus能在氮素充足的環(huán)境中快速成為優(yōu)勢菌屬,隨著(zhù)發(fā)酵的持續和氮素的消耗,對照中Methanoculleus的豐度要高于處理。說(shuō)明 Methaoculeus可以充分利用秸稈分解后的營(yíng)養物質(zhì)成為環(huán)境中優(yōu)勢菌屬,在環(huán)境中有較強的競爭力和適應能力。在發(fā)酵初期,氮素處理產(chǎn)氣顯著(zhù)高于對照,可以看出在玉米秸稈厭氧發(fā)酵過(guò)程中, Methanoculleus對產(chǎn)氣的貢獻更大。隨著(zhù)發(fā)酵的進(jìn)行,對照產(chǎn)氣量持續提升,較處理產(chǎn)氣率高,其中的甲烷桿菌屬( Methanobacterium)豐度逐漸提升,對產(chǎn)氣提升做出了較大貢獻。

2.3玉米秸稈新型沼氣池沼氣發(fā)酵體系宏基因組學(xué)研究  2.3.1物種豐度差異分析

前期16 SrRNA gene測序分析已經(jīng)證明在發(fā)酵  10d處理和對照在豐度上存在差異,利用宏基因組  數據可以進(jìn)一步分析每個(gè)樣本在各分類(lèi)學(xué)水平的組  成豐度分布,逐一比較每個(gè)分類(lèi)單元在兩個(gè)樣本之間的豐度差異,并通過(guò)統計檢驗評價(jià)差異是否顯著(zhù)。  處理與對照在門(mén)水平上有27個(gè)門(mén)具有顯著(zhù)差異,屬  水平上有475個(gè)屬具有顯著(zhù)差異,在種水平上有777個(gè)種具有顯著(zhù)差異(見(jiàn)表3)。物種豐度的變化直接影響新型沼氣池沼氣發(fā)酵體系群落的功能性,尤其是功能

菌種豐度的顯著(zhù)變化,通過(guò)以上數據可知,氮素添加  能夠顯著(zhù)影響發(fā)酵體系中微生物的豐度。

2.3.2功能基因差異分析

在功能基因水平上,我們分析了能量代謝中各功能基因的豐度(見(jiàn)圖6),發(fā)現氮素處理中甲烷代謝( methane metabolism)的豐度高于處理,而氧化磷酸化等有關(guān)能量代謝的基因的豐度變化不明顯。甲烷代謝基因是產(chǎn)甲烷的關(guān)鍵基因,氮素添加提升了甲烷代謝基因的豐度。

討論

Wagner"等研究了多種氮源添加對產(chǎn)氣高峰期的影響,與本研究的氮素添加后產(chǎn)氣高峰提前且一段時(shí)間產(chǎn)氣量顯著(zhù)提升的研究結果一致,但沒(méi)有對多周期發(fā)酵進(jìn)行測定。我們在研究氮素添加的半連續發(fā)酵結果顯示,處理在中后期產(chǎn)氣能力低于對照。氮素添加雖然促進(jìn)了纖維素的水解,為古菌的代謝提供了營(yíng)養底物。但隨發(fā)酵進(jìn)行,處理中其它微生物所需的元素和營(yíng)養底物被大量消耗,后期雖然氮素含量和對照持平,但根據元素守恒定律,其它必需元素含量會(huì )低于對照。而對照初期由于氮素含量和其他營(yíng)養物質(zhì)含量低,細菌代謝和纖維素水解受到限制,隨著(zhù)發(fā)酵的進(jìn)行,纖維素水解產(chǎn)物等營(yíng)養物質(zhì)含量增加,細菌和古菌多樣性逐漸提高,產(chǎn)氣潛力開(kāi)始顯現。但整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中處理的纖維素等物料的水解率顯著(zhù)高于對照,提供了更多的營(yíng)養物質(zhì),處理的總甲烷產(chǎn)量仍高于對照。

在發(fā)酵起始階段 Clostridium豐度占比較高,這與 Weimer1)等發(fā)現 Clostridium能夠將纖維素和半纖維素等大分子水解成葡萄糖的結果一致。甲烷八

更球菌屬( Methanosarcina)等產(chǎn)甲烷古菌的豐度提  升可能和產(chǎn)酸菌群一樣受氮素含量和底物濃度影  響。產(chǎn)氣高峰期 Methanosarcina豐度增加,對產(chǎn)甲  具有較大貢獻,這與 Bharathi等的研究結論一  hmm在處理和對照中豐度一直占據優(yōu)  致。  ,Cam2)等發(fā)現 Methanosaeta有較強的產(chǎn)甲烷能  力結論與本研究結果相似。發(fā)酵體系中還注釋到  Sphaerochaeta,AbtB(21等曾在白蟻的腸道中分離出  該均屬。 Ritalaht(2等曾在紅杉河底層沉積物中分  離出 Sphaerochaeta globosa,發(fā)現其能利用多種底物  進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)甲酸鹽和乙酸鹽。但在新型沼氣池沼氣發(fā)酵體系  中,鮮有關(guān)于 zerochaeta的報道,其在玉米秸稈降  解產(chǎn)甲烷環(huán)境中可能具有重要作用。  張彩杰2等在研究了C/N對細菌群落的影響時(shí)發(fā)現碳氮比降低,細菌多樣性提升,優(yōu)勢菌群豐度增高,這與本研究發(fā)現細菌的變化規律相同。本研究還分析了在產(chǎn)甲烷階段具有重要作用的古菌群落多樣性,發(fā)現古菌的群落多樣性變化和細菌相似對于食氫產(chǎn)甲烷菌和食乙酸產(chǎn)甲烷菌來(lái)說(shuō),豐富的

養底物可以被利用進(jìn)行代謝,此時(shí),產(chǎn)甲烷功能基因的豐度要比環(huán)境中微生物的多樣性更為重要Lin(21等發(fā)現功能基因的多樣性提升不利于代謝途徑的有序性,并且可能帶來(lái)更多的功能冗余,在探究有關(guān)能量代謝的基因豐度變化時(shí)發(fā)現,甲烷代謝相關(guān)基因豐度的增加和新型沼氣池沼氣產(chǎn)量呈正相關(guān),與Qiang23等研究溫度對新型沼氣池沼氣發(fā)酵體系影響的結果致。雖然本研究沒(méi)有探究功能基因的多樣性與產(chǎn)氣量的關(guān)系,但處理中的甲烷代謝功能基因表達顯得更為集中。這說(shuō)明氮素的添加和溫度一樣對甲烷代謝的功能基因具有調節作用。

本研究發(fā)現處理中古菌的多樣性雖然提升了,  但甲烷代謝的功能基因的豐度并沒(méi)有降低,說(shuō)明微  生物多樣性提升和功能基因的集中表達不存在矛  盾。 Shade20等認為微生物的多樣性只是環(huán)境微生  物中一個(gè)單純的指標,我們同樣認為多樣性的高低  不能直接說(shuō)明一定的問(wèn)題,復雜的代謝過(guò)程需要多  種功能微生物共同參與,又或者環(huán)境中微生物多樣性低,而重要的功能微生物豐度又占據絕對優(yōu)勢,或許這正是我們想要的,但自然環(huán)境往往不是這樣的,這同樣需要在具體的環(huán)境中分析。

4結論

(1)以玉米秸稈為原料的厭氧新型沼氣池沼氣發(fā)酵過(guò)程

中,利用16 SrRNA gene和宏基因組測序技術(shù)分析發(fā)現,氮素添加能夠提升厭氧發(fā)酵過(guò)程中細菌的多樣性和豐度,細菌多樣性的變化特別是具備纖維素降解功能菌株豐度的提升能夠加速纖維素、半纖維素等物質(zhì)的水解和代謝過(guò)程。氮素添加和纖維素等物質(zhì)的加速分解有效的提升了反應器內古菌代謝所需  的營(yíng)養底物,提升了古菌的多樣性和豐度,促進(jìn)了產(chǎn)甲烷古菌的代謝和甲烷代謝基因豐度的提升。  (2)氮素添加通過(guò)提升微生物的豐度以及產(chǎn)甲  烷功能基因的豐度,縮短了達到產(chǎn)氣高峰所需的周  期,并在一段時(shí)間內維持穩定的產(chǎn)氣量和甲烷含量,  最終在整個(gè)發(fā)酵周期內顯著(zhù)提升新型沼氣池沼氣產(chǎn)氣量和TS甲烷產(chǎn)率。

摘自《中國沼氣》第5期 趙一全 馬茹霞 李家威 晏磊 羅濤 梅自力 王偉東